鼻咽癌中辐射诱导的CCL22的表达增强与

白癜风专家李从悠 http://disease.39.net/bjzkbdfyy/170602/5422078.html

原文出处

LiH,ChenX,ZengW,ZhouW,ZhouQ,WangZ,JiangW,XieB,SunLQ.Radiation-EnhancedExpressionofCCL22inNasopharyngealCarcinomaisAssociatedWithCCR4+CD8TCellRecruitment.IntJRadiatOncolBiolPhys.Sep1;(1):-.doi:10./j.ijrobp..05..EpubMay16.PMID:.

研究背景

放射治疗是早期鼻咽癌的标准治疗方法，对于局部晚期鼻咽癌主要采用放疗与化疗联合的综合治疗模式，放射治疗在鼻咽癌的治疗中必不可少。

放射治疗具有免疫刺激作用，接受照射的癌细胞或肿瘤组织产生一系列细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1、白细胞介素-6、粒细胞集落刺激因子和TGF-β，并释放一些趋化因子，包括CCL2和CXCL12。此外，辐射增强了HIF1-α的表达，已知HIF1-α诱导许多细胞因子、趋化因子和生长因子的表达，包括CXCL12、CCL2和血管内皮生长因子。C-C类趋化因子22（CCL22），一种最初被称为巨噬细胞合成趋化因子（MDC）的因子，与其受体C-C趋化因子受体4（CCR4）一起在炎症反应中起重要作用。CCL22主要由M2型巨噬细胞产生，通常与Th2反应有关。CCR4在Th2细胞和调节性T细胞（Treg）表面表达，这些表达CCR4的细胞可以被CCL22募集到肿瘤微环境中。趋化因子CCL2和CXCL12将肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）招募到受照射的肿瘤组织中。

CD8+T细胞在辐射诱导的免疫反应中扮演重要角色，研究发现：15Gy照射剂量治疗小鼠肿瘤，在CD8+T细胞的消除的条件下抗肿瘤效果大大下降。此外，通过向原发性肿瘤内注射Ad-LIGHT的CTL生成免疫疗法可以增强辐射介导的转移根除效果14。

根据这些发现，本文作者利用鼻咽癌的PDX模型和各种细胞系，揭示了放疗可以增强鼻咽癌细胞中CCL22的表达，CCL22可以将CCR4+CD8T细胞募集到肿瘤微环境中，这有助于提高放疗诱导的抗肿瘤疗效并改善鼻咽癌患者的预后。

研究结果

结果一、放疗增加鼻咽癌的人源肿瘤异种移植模型（PDX）中CCL22的表达

为研究放疗引起的鼻咽癌肿瘤基因表达的动态变化，研究人员将鼻咽癌活组织接种于balb/c裸鼠皮下，三次传代后获得了六只携带PDX组织的小鼠，将这些肿瘤定义为源自同一患者的P3肿瘤。当PDX肿瘤的体积达到mm3，将小鼠随机分成3组，每组2只小鼠（图1A），分别给予0Gy、2Gy或4Gy（2Gy/天，持续2天）剂量的照射。放射治疗后24小时提取肿瘤细胞，再提取核糖核酸（图1B）。研究人员将基因表达总数表示为每百万千碱基的片段数，以spearman相关矩阵的形式调整基因表达的差异。P0肿瘤（来自患者的原发肿瘤组织）和PDX肿瘤之间的Pearson相关系数超过0.93（R20.93），而PDX肿瘤之间的相关系数超过0.97（R20.97）。研究结果表明PDX肿瘤和原发性组织产生具有相似的基因表达模式（图1C）。

原发性肿瘤和PDX肿瘤中富集途径分布的区别表明：与原发性组织相比，免疫应答相关途径的基因表达在PDX肿瘤中丢失（图1D和E）。与未接受放射治疗的肿瘤相比，接受总剂量为2Gy或4Gy放射治疗的肿瘤显示出显著的变化（图1F和G）。研究人员发现37个上调基因在有或无辐射的肿瘤的不同基因表达组中是共有的（图1H，表S1）。值得注意的是，与细胞因子介导的途径和免疫细胞迁移相关的基因，如趋化因子CCL22，显示了最大的重叠（图1H和表S1）。研究人员比较了所有趋化因子配体，发现CCL22在PDX肿瘤中以辐射剂量依赖的方式显著增强（图1J）。研究结果表明辐射可以增强肿瘤细胞中CCL22的表达。

图1

表S1

结果二、辐射增加了CCL22的表达和释放

为了解CCL22在肿瘤组织和邻近非肿瘤组织中表达的差异，研究人员采用TCGAHNSC数据库进行分析。通过分析大量的RNA-seq数据，在肿瘤组织和非肿瘤组织中没有观察到CCL22表达的差异（图2A），而对SCRNA-seq数据库进行分析，结果显示：与肿瘤细胞相比，非肿瘤细胞所表达的CCL22高得多（图2B）。对15名患者进行Violin图分析，结果显示CCL22在肿瘤细胞中的表达非常低（图2C）。

考虑到与放疗前的肿瘤组织相比，放疗后PDX肿瘤中CCL22的表达增加，研究人员假设放疗可以增加肿瘤细胞中CCL22的表达。为了验证这一点，研究人员检测了一组鼻咽癌细胞系对辐射的反应，这组细胞系包含有11个鼻咽癌细胞系。与未接受辐射处理的细胞相比，除了HNE1细胞（图2D）之外，所有接受照射的细胞都表达更高水平的CCL22mRNA，这与在PDX模型中观察到的结果几乎一致（图1H和J）。为了明确辐射增加了细胞内CCL22还是增加了细胞外CCL22，研究人员通过酶联免疫吸附试验分别检测了细胞裂解物和上清液中的CCL22蛋白水平。结果显示经过放射处理的细胞裂解物和上清液中的CCL22表达水平都有所增加（图2E和F）。研究结果表明大多数鼻咽癌细胞表达低水平的CCL22，而辐射后表达水平显著升高。

图2

结果三、CCL22不影响肿瘤细胞的恶性表型

由于放射治疗增加了CCL22在细胞内和细胞外的表达，研究人员测试了CCL22是否会影响肿瘤细胞的恶性表型。用CCL22转染HNE2、HNE3、CNE1、CNE2和HK1细胞，用逆转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验测定表达效率（图S1A-D）。有趣的是，并没有观察到过表达CCL22的细胞增殖的显著变化（图3A）。与相同体积的PBS相比，用不同浓度的人重组CCL22处理HNE2、HNE3、CNE1、CNE2和HK1细胞3天，没有观察到增殖的改变（图3B）。Boydenchamber迁移试验表明，肿瘤细胞的移动性与CCL22无关（图3C，图S1E）。用一定浓度范围的重组CCL22孵育细胞，细胞的迁移率与对照组几乎相同（图3D，图S1F）。

为了评估CCL22是否影响肿瘤细胞的辐射敏感性，研究人员给予有或没有CCL22过表达的HNE2、HNE3、CNE1、CNE2和HK1细胞4Gy照射。在有和没有CCL22过表达的细胞群没有观察到明显的凋亡差异（图3E）。此外，CCL22过表达细胞的克隆形成存活率与对照组细胞没有显著差异（图3F）。研究结果表明CCL22不影响鼻咽癌细胞的恶性表型，包括增殖、迁移和辐射敏感性。

图S1

图3

结果四、CCL22与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）信号呈正相关，有助于改善头颈部鳞癌（HNSC）患者的预后

CCL22是CCR4的趋化因子配体，主要在免疫细胞中表达，特别是Tregs。研究人员分析了TCGA的数据，发现CCL22的表达与HNSC肿瘤组织中CCR4的表达呈显著正相关，表明CCL22可能将表达CCR4的细胞募集到肿瘤组织中（图4A）。鉴于CCR4在Treg功能中的重要作用，研究人员评估了肿瘤组织中CCL22表达和Foxp3（Treg的一种特异性标记）之间是否存在相关性，发现CCL22表达与Foxp3表达呈明显正相关（图4B）。CCL22在招募Tregs中起重要作用，这通常与肿瘤患者的不良预后有关，研究人员用TCGA和Kaplan-MeierPlotterHNSC数据库来分析CCL22或CCR4的表达对HNSC患者预后的影响。Kaplan-Meier生存分析显示，CCL22和CCR4有助于改善患者预后（图4F和G）。研究人员的假设是：CCL22和CCR4的存在也许会因Treg细胞的募集而导致预后不良。研究结果明显与假设不符。

为了揭示CCL22和CCR4有助于改善患者预后的原因，研究人员分析了CCL22和不同类型免疫细胞的所有信号之间的相关性，并发现CCL22在HNSC肿瘤组织中的表达与CD8CTL信号正相关，包括CD8A、IFNG、GZMA、GZMB、NKG7和PRF1（图4C）。类似地，CCR4和FOXP3两者都是Tregs的特异性标记，二者之间呈正相关（图4D）。此外，CCR4与CTL信号呈正相关（图4E）。接着，研究人员基于CCL22或CCR4相关CTL信号分析患者的预后。与双低表达分子特征的患者相比，双高表达分子如CCL22高/CCR4高、CCL22高/CD8A高、CCL22高/IFNG高、CCL22高/GZMB高、CCR4高/CD8A高、CCR4高/IFNG高或CCR4高/GZMB高的患者预后更好，三年中位生存期更长（图4H和I）。

多时间间隔分析显示，CCL22或CCR4高表达的患者存活率较高（图S2A）。此外，研究人员观察到CCL22和CCR4、CCR4和CD8A、CCL22和CTL信号在不同癌症类型中的表达呈正相关，其中CCL22的高表达改善了患者的预后（图S2B-F）。研究结果表明CCL22可能将CTL募集到肿瘤组织中。

图S2

图4

结果五、肿瘤组织中存在表达CCR4的效应CD8T细胞亚群

为了确定CCL22是否能够募集CTL，研究人员首先评估了CCR4在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中的表达。有趣的是，基于对TCGAscRNA-seq数据集的分析，在非肿瘤细胞中观察到高表达的CCR4，而肿瘤细胞的CCR4表达几乎为阴性（图5A）。之后，他们将非肿瘤细胞分为T细胞和其他非肿瘤细胞，发现T细胞表达更高水平的CCR4，这有助于将T细胞分为亚型进行进一步分析（图5B，表S2）。显然，在该数据集中观察到表达CCR4的细胞，包括原始CD4T细胞、CMCD4T细胞、效应CD4T细胞、原始CD8T细胞、中枢记忆（CM）CD8T细胞、效应CD8T细胞、衰竭CD8T细胞和Tregs，但效应记忆（EM）CD4T细胞和EMCD8T细胞除外（图5C）。

在TCGAscRNA-seq数据集中，表达CCR4的T细胞的比例为7.49%，其中9.68%的细胞表现出效应CD8T细胞的特征。这些表达CCR4的细胞在所有效应CD8T细胞中占6.7%（图5E）。

热图分析显示表达CCR4和CCR4阴性的细胞都可以进一步分为不同的亚类（图5F，图S3A-H）。GO生物过程分析表明，与RNA剪接或姐妹染色单体分离和细胞周期调控相关的基因分别在Po-3和Po-9细胞中特异性富集。此外，调节凋亡过程、蛋白质修饰、运输、ncRNA加工、对肿瘤坏死因子或应激反应的基因在不同的CCR4阴性细胞中特异性富集（图5G）。在多维标度（MDS）和基于CCR4状态的t-SNE分析中，没有观察到基因表达模式的显著差异（图5H和I）。研究表明肿瘤组织中存在表达CCR4的效应CD8T细胞亚群。

图5

表S2

图S3

结果六、CCL22增加表达CCR4的CD8T细胞的趋化性

研究人员发现：包括效应CD8T细胞在内的几种CD8T细胞表达CCR4，因此他们假设CCR22能够募集表达CCR4的CD8T细胞。从健康志愿者的外周血单核细胞中收集CD3+CD8+T细胞，其中约4%的CD3+CD8+T细胞群表达CCR4（图6A）。与CCR4阴性对照组相比，CCL22可以募集来自外周血的表达CCR4的CD3+CD8+T细胞（图6B）。

接下来研究人员收集了18名鼻咽癌患者放疗前后的血清样本以确定局部放疗是否会增加头颈部鳞癌患者血液循环中的CCL22，结果与在PDX模型中观察到的结果一致：与治疗前从同一患者收集的血清样本相比，在接受射线照射后的大多数血清样本中发现CCL22水平升高。接着研究人员利用4名患者在放疗前和放疗后1周或放疗后2周采集血清样本进行进一步分析，发现CCL22水平在放疗过程中持续升高（图6C，表S3）。

上述研究结果表明辐射对鼻咽癌细胞中CCL22的表达有显著影响，CCL22可以释放到肿瘤微环境和循环系统，从而达到募集表达CCR4的CD8T细胞的作用（图6D）。

图6

研究结论：

1、放疗增加鼻咽癌细胞中趋化因子CCL22的表达和释放。

2、细胞内和细胞外CCL22的增加不会影响肿瘤细胞的恶性表型，比如增殖、迁移和放射敏感性。

3、CCL22的增加提高了表达CCR4的效应CD8T细胞的趋化性，这有助于通过抗肿瘤免疫反应改善头颈部鳞癌患者的预后。

校对：杨格

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