葫芦素B诱导人鼻咽癌细胞铁死亡的分子机制

研究背景：

葫芦素B(CucurbitsinB，CUB)是一种广泛存在的三萜类分子，具有多种生物活性。在传统医学中，CUB通过调节多个信号通路而表现出强大的抗真菌、抗菌、解热、抗炎和抗癌活性。据报道，CUB通过诱导细胞凋亡和相关途径对多种肿瘤细胞株(包括肝癌、乳腺癌细胞和胰腺癌细胞株具有很强的抗肿瘤活性。以往对CUB)抗肿瘤机制的研究主要集中在细胞凋亡方面，而对其诱导铁死亡作用的研究报道较少。铁死亡是一种新发现的铁依赖性细胞死亡(PCD)，不同于已有研究的细胞凋亡、坏死和自噬等PCD。铁死亡被铁螯合剂或亲脂性抗氧化剂抑制，其特征是细胞内脂质过氧化物积聚。越来越多的研究表明，功能性铁死亡参与了许多人类疾病和致病过程的进展，包括癌变、缺血再灌注损伤、创伤性脊髓损伤和神经退行性疾病。y因此，作者对CUB进行了研究，发现了CUB对人鼻咽癌细胞具有良好的细胞毒作用，并阐明了其潜在的铁死亡诱导机制。

研究思路：

作者首先使用MTT法来评估CUB影响各种癌细胞代谢状态的能力。与其他癌细胞相比，鼻咽癌细胞株CNE1对CUB最敏感(IC50=16nM)，作用48h后，CNE1对CUB的敏感性最强(IC50=16nM)。因此，选择CEN1细胞株作为进一步研究的对象。最近的研究表明，CUB及其衍生物可诱导肿瘤细胞凋亡。因此，作者首先采用AnnexinV/PI染色方法研究CNE1细胞是否通过凋亡而死亡。相当出人意料的是，在浓度低于NM的CUB处理后，凋亡细胞的水平略有增加(图2A)。此外，Westernblot分析结果显示，CUB降低了caspase-3和PARP的表达，提高了caspase-3的裂解水平，并在较高浓度(-0nM，远高于CUB的IC50值)时裂解PARP(图2B)。此外，只有较高浓度的CUB(,,0nM)才能引起凋亡相关蛋白BAD，BCX-XL，Bax，bcl-2，caspase-7/9，裂解caspase-7/9的表达水平的改变。

从以上结果(表1和图2)可以得出结论，诱导细胞凋亡的浓度远远超过CUB的IC50值，作者推测CUB还可能诱导其他形式的细胞死亡。因此，为了确定细胞死亡的方式，分别用泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂(ZVAD)、坏死抑制剂(Nec1)或铁下垂抑制剂(DFO、CPX和Fer-1)进行预处理，以确定这些抑制剂是否中和CUB对CNE1细胞的细胞毒作用。如图3A所示，只有铁死亡抑制剂能有效防止CUB诱导的细胞死亡。据报道，DFO是一种铁死亡抑制剂，具有铁离子螯合能力，它挽救了CUB的细胞毒性，表明CUB诱导的细胞死亡是不依赖的。图3B的结果也验证了CUB(50NM)诱导LDH释放的显著效果和铁死亡抑制剂的中和作用(图3B)。细胞形态学研究表明，CUB(50NM)诱导了显著的形态学改变，如明显的气球特征和细胞肿胀，但缺乏经典的凋亡特征，如细胞收缩、变圆和染色质凝聚(图3C)。这些形态学改变与已报道的典型的铁死亡特征一致。同样，这些形态学改变对铁死亡抑制剂的反应明显逆转，但对凋亡抑制剂或坏死抑制剂没有观察到相应的反应(图3C)。总体而言，CUB可能以铁死亡的形式触发CNE1细胞死亡，最终导致细胞死亡。

铁死亡的形态学特征是线粒体形态特征的改变。为了验证CUB对CNE1的铁死亡诱导作用，作者用透射电镜观察了CUB诱导的线粒体超微结构的改变。图4A所示的透射电镜结果显示，经CUB(50NM)处理后，CNE1细胞内线粒体缩小，线粒体膜密度增加，线粒体嵴减少，这与以往有关铁死亡的报道一致。同样，10μM的Erastin刺激对线粒体结构也有类似的影响。这些形态学改变表明，CUB诱导的CNE1细胞程序性死亡不同于经典的凋亡性细胞死亡。铁是线粒体呼吸链中的一种基本元素，在铁死亡中起着关键作用。因此，作者测量了细胞内的铁浓度。如图4B所示，CUB处理后细胞内铁浓度呈剂量依赖性增加。铁的丰富有助于细胞对铁死亡的易感性。此外，DFO、CPX和Fer-1中和了CUB诱导的细胞毒性(图3e)。总之，作者的数据表明，CUB以铁依赖的方式启动了CNE1细胞的死亡过程。细胞内谷胱甘肽水平降低导致过度氧化应激，是铁死亡介导的细胞死亡的关键因素。细胞内依赖谷胱甘肽的抗氧化剂失活会促进脂质过氧化产物的积累，进而引发铁死亡。如图4B所示，CUB使细胞内GSH含量在6h后显著下降，并持续到24h，提示CUB引起的GSH耗竭可能促进细胞抗氧化能力的下降，可能是导致铁死亡的重要因素。过氧化脂质被认为是铁死亡的驱动力，也是铁死亡的标志。荧光探针C11-BODIPY/是一种脂质过氧化敏感染料。流式细胞仪分析显示，经CUB处理后，细胞脂质过氧化显著增加，且呈剂量依赖关系(图4D)。同样，DFO、CPX和Fer-1也能抑制CUB诱导的脂质过氧化堆积。另外，用CUB(图4E)处理的细胞中强烈的绿色荧光强度显示了CNE1细胞的脂质过氧化过程，这意味着CUB有效地引起了脂质过氧化。硒蛋白Gpx4被认为是减少过氧化氢，特别是脂质过氧化的关键酶，其代价是两个谷胱甘肽分子的氧化。以上结果证明了CUB降低谷胱甘肽水平，诱导脂质过氧化。为了进一步评价CUB的铁性死亡触发作用，作者还研究了CUB对细胞间Gpx4表达的影响。CUB在暴露6h和12h后对Gpx4的表达几乎没有影响。然而，经CUB(图4F)处理24小时后，CNE1细胞中Gpx4的转录水平和蛋白表达显著下降，并呈剂量依赖性，这种下调效应可以被DFO所抵消。进一步证实了CUB在CNE1细胞中具有潜在的铁蛋白诱导作用。此外，CUB在体外即使在很高的浓度(12.5-μM)下也不能抑制Gpx4酶的活性。综上所述，以上结果提示CUB可能首先引起细胞内GSH耗竭，随后Gpx4表达下调，最终导致细胞铁死亡。

为了进一步了解CUB的抗肿瘤作用，作者评估了CUB治疗对细胞骨架的损害。细胞与CUB(50NM)孵育24h后，激光共聚焦扫描显微镜观察细胞骨架网络。CUB对CNE1细胞的细胞骨架有明显的损伤作用。为了进一步研究CUB对微管生长的影响，作者评估了冷诱导解聚后的微管重组，以表征细胞内微管再生的动力学。如图5A所示，对照细胞中的微管在预热过程中重新聚合，并在15分钟内建立了适当的微管网络。相反，在用CUB处理的细胞中，微管在间期没有重组。这些结果表明，CUB抑制微管组装，从而导致细胞内微管的破坏。鉴于CUB对癌细胞株具有较强的抗增殖活性，还进行了体外微管蛋白聚合抑制实验。即使细胞与高浓度的CUB(50μM)孵育，微管蛋白聚集的趋势也不受抑制。这些结果进一步证实了CNE1细胞暴露于幼鼠体内会破坏细胞骨架，并伴有铁死亡的发生。

考虑到微管在细胞有丝分裂中的重要调节作用，作者对细胞周期不同时相的细胞DNA含量进行了测定。nM的CUB处理24小时后，处于G2/M期的细胞百分比增加了近4倍(图5B)。CUB处理组细胞周期阻滞于G2/M期，G1、S期细胞百分率下降。为了进一步阐明CUB对细胞周期的功能影响，通过Westernblotting检测了细胞周期相关蛋白的表达。CUB显著降低CNE1细胞中cyclinB1、cdc2和cdc25C的水平，而增加p-cdc2的水平(图5C)。这些结果表明，CUB诱导细胞周期阻滞于G2/M期。

为了确定CUB是否能抑制CNE1细胞的迁移和侵袭，作者采用了有或没有Matrigel的Transwell实验。如图6A，B所示，观察到CUB对CNE1细胞迁移和侵袭的抑制作用。CNE1细胞的迁移和侵袭能力明显降低，并呈剂量依赖性。为了进一步研究EMT的分子机制，采用Westernblotting方法检测了调控细胞迁移和侵袭的相关蛋白的表达。如图6C所示，CUB显著下调鼻咽癌细胞中Slug、β-catenin和Ncadherin的表达，而上调E-cadherin和Snail的表达。这些结果表明，CUB对CNE1细胞具有抗转移作用。

在上述体外实验的基础上，作者建立人鼻咽癌小鼠移植瘤模型，每隔3天腹腔注射CUB(0.5mg/kg和1mg/kg)、吉西他滨(25mg/kg)或空白对照(PBS)，观察CUB对BALB/c小鼠的体内抗肿瘤作用。结果表明，CUB/c小鼠腹腔注射CUB(0.5mg/kg和1mg/kg)、吉西他滨(25mg/kg)或对照(PBS)对CNE1荷瘤小鼠均有一定的抑瘤作用。选择临床肿瘤治疗中常用的化疗药物吉西他滨作为阳性对照。CUB治疗抑制小鼠肿瘤生长(图7A，B)。观察期结束时，对照组平均肿瘤体积为1.1±0.40cm3，对照组为0.29±0.13cm3(0.5mg/kg幼鼠)，0.18±0.06cm3(1mg/kg幼鼠)，0.32±0.09cm3(25mg/kg吉西他滨)。为了评估副作用，对每组小鼠的体重变化进行了监测和记录。图7C总结了体重。对照组平均体重为22.1±1.71g，仔鼠平均体重为20.9±0.97g(0.5mg/kg仔鼠)，仔鼠平均体重为21.9±0.77g(1mg/kg仔鼠)。吉西他滨25mg/kg组小鼠平均体重为21.4±1.11g，说明幼鼠给药耐受性好，具有良好的生物相容性，不会导致小鼠体重明显下降。结果表明，吉西他滨25mg/kg组小鼠平均体重为21.4±1.11g，具有良好的耐受性和良好的生物相容性。此外，吉西他滨治疗组的结果与幼鼠(低剂量)治疗组相似。相比之下，高剂量幼鼠组的肿瘤组织明显小于吉西他滨组小鼠的肿瘤组织。这些结果表明，在体内，大剂量(1mg/kg)的幼鼠比一线治疗的吉西他滨(25mg/kg)更有效。此外，幼崽给药后，血液分析显示幼崽对几项血液生化指标没有明显影响(表2)。用HE染色观察治疗36d后4组大鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的病理形态学变化。在所有治疗的小鼠中都没有观察到明显的内脏毒性或转移迹象(图8)。总体而言，作者的研究结果表明，CUB在体内具有抗肿瘤作用，应该进一步考虑用于癌症治疗。

结论：

在这项研究中，作者首次揭示了CUB通过铁死亡途径诱导细胞死亡。此外，详细的机制表明，CUB强烈地促进了铁离子的积累和GSH的耗竭，导致过量过氧化脂质的产生。此外，CUB还下调了Gpx4的表达，从而启动了CNE1细胞铁死亡的多管齐下机制。此外，作者还在体外和体内实验中确定了CUB对肿瘤的抑制作用。基于这些发现，作者认为CUB作为铁死亡诱导剂开发的一种有前景的天然候选药物具有治疗应用价值。CUB可能是一种很有前途的抗肿瘤化疗诱导剂。

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